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描述:測定意義線粒體復(fù)合體Ⅴ又稱F1F0-ATP合酶,廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體中,由F1和F0兩個(gè)亞單位組成。該酶利用呼吸鏈產(chǎn)生的質(zhì)子電化學(xué)梯度催化ATP合成,也可逆過程水解ATP。此外,復(fù)合體Ⅴ還存在于葉綠體、異養(yǎng)菌和光合細(xì)菌中。復(fù)合體Ⅴ是線粒體氧化磷酸化和葉綠體光合磷酸化合成ATP的關(guān)鍵酶。線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅴ活性檢測試劑盒
標(biāo)題:線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅴ活性檢測試劑盒
產(chǎn)品概述
線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅴ活性檢測試劑盒
測定原理
復(fù)合體Ⅴ水解ATP產(chǎn)生ADP和Pi,通過測定Pi增加速率來測定復(fù)合體Ⅴ活性。
需自備的儀器和用品
可見分光光度計(jì)、臺式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配制
試劑一:25mL×1瓶,-20℃保存;
試劑二:25mL×1瓶,-20℃保存;
試劑三:1 mL×1瓶,-20℃保存;
試劑四:粉劑×1支,-20℃保存;臨用前每支加入1.3mL雙蒸水,充分溶解備用,用不完的試劑仍-20℃保存;
試劑五:6mL×1瓶,4℃保存;
試劑六:粉劑×1瓶,4℃保存;臨用前加入3mL雙蒸水,充分混勻;
試劑七:粉劑×1瓶, 4℃保存;臨用前加入10mL雙蒸水,充分混勻;
試劑八:粉劑×1瓶, 4℃保存;臨用前加入10mL雙蒸水,充分混勻;
試劑九:液體10mL×1 瓶,室溫保存。
定磷試劑的配制:按H2O: 試劑七:試劑八:試劑九=2:1:1:1 的比例配制,配好的定磷試劑應(yīng)為淺黃色。若無色則試劑失效,若是藍(lán)色則為磷污染(請根據(jù)需要,用多少配多少)。
注意:配試劑用新的燒杯、玻棒和玻璃移液器,或者一次性塑料器皿,以避免磷污染。
復(fù)合體Ⅴ的提取
測定步驟
1、酶促反應(yīng)
試劑名稱(μL) | 對照管 | 測定管 |
試劑四 | 50 | 50 |
試劑五 | 200 | 200 |
樣品 |
| 250 |
混勻, 37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)準(zhǔn)確水浴30min
試劑六 | 100 | 100 |
樣品 | 250 |
|
混勻,4000g,室溫離心10min,取上清液
2、定磷
上清液 | 250 | 250 |
定磷試劑 | 1250 | 1250 |
混勻,室溫靜置10min左右,在 660nm處用對照管調(diào)零,讀取測定管吸光值
線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅴ活性檢測試劑盒
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