標(biāo)題：線粒體異檸檬酸脫氫酶（ICDHm）檢測(cè)試劑盒

產(chǎn)品概述

線粒體異檸檬酸脫氫酶(ICDHm)檢測(cè)試劑盒

測(cè)定原理

ICDHm催化NAD⁺ 還原生成NADH，導(dǎo)致340nm處光吸收上升。

需自備的儀器和用品

紫外分光光度計(jì)、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1 mL石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制

試劑一：50mL×1瓶，-20℃保存；

試劑二：10mL×1瓶，-20℃保存；

試劑三：1mL×1支，-20℃保存；

試劑四：液體60mL×1瓶，4℃保存；

試劑五：粉劑×1支，4℃保存；

試劑六：粉劑×1支，-20℃保存；

試劑七：粉劑×1支，-20℃保存; 臨用前加入3mL雙蒸水充分混勻待用，用不完的試劑仍-20℃保存。

工作液的配制：臨用前把試劑五、試劑六轉(zhuǎn)移到試劑四中混合溶解待用。

ICDHm的提取

1. 準(zhǔn)確稱取約0.1g組織或收集約500萬細(xì)胞，加入1mL試劑一和10uL 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽研磨。
2. 4 ℃ 600 g離心5min。
3. 棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，4 ℃ 11000 g離心10min。
4. 上清液即胞漿提取物，可用于測(cè)定可能從線粒體泄漏的ICDHm（此步可選做）。
5. 在沉淀中加入200uL試劑二和2uL 試劑三，超聲波破碎（功率20％，超聲3秒，間隔10秒，重復(fù)30次），用于線粒體ICDHm活性測(cè)定。

測(cè)定步驟

1. 調(diào)零

用蒸餾水于340nm處調(diào)零。

1）取1mL工作液加入1mL石英比色皿，在37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）孵育5min。

（2）取出比色皿，再依次加入60μL試劑七和80μL樣本，混勻；加入樣本的同時(shí)開始計(jì)時(shí)，立即記錄340nm處20s的吸光值A1，37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）中準(zhǔn)確反應(yīng)2min，記錄340nm處2min20s時(shí)的吸光值A2，計(jì)算ΔA=A2-A1。

注意事項(xiàng)

1、測(cè)定過程中所有試劑和樣本在冰上放置，以免變性和失活。

2、比色皿中反應(yīng)液的溫度必須保持37℃或25℃，取小燒杯一只裝入一定量的37℃或25℃蒸餾水，將此燒杯放入37℃或25℃水浴鍋中。在反應(yīng)過程中把比色皿連同反應(yīng)液放在此燒杯中。

3、兩個(gè)人同時(shí)做此實(shí)驗(yàn)，一個(gè)人比色，一個(gè)人計(jì)時(shí)，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

線粒體異檸檬酸脫氫酶(ICDHm)檢測(cè)試劑盒