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P產(chǎn)品分類RODUCT CATEGORY
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描述:測定原理PK催化磷酸烯醇式丙酮酸和ADP生成ATP和丙酮酸,乳酸脫氫酶進(jìn)一步催化NADH和丙酮酸生成乳酸和NAD+,在340nm下測定NADH下降速率,即可反映PK活性。丙酮酸激酶(PK)檢測試劑盒
標(biāo)題:丙酮酸激酶(PK)檢測試劑盒
產(chǎn)品概述
丙酮酸激酶(PK)檢測試劑盒
測定意義
PK(EC 2.7.1.40)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中,催化糖酵解過程中的后一步反應(yīng),是糖酵解過程中的主要限速酶之一,也是產(chǎn)生ATP的關(guān)鍵酶之一,因此測定PK活性具有重要意義。
需自備的儀器和用品
紫外分光光度計(jì)、臺式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水
試劑的組成和配制
提取液:60mL×1瓶,4℃保存;
試劑一:液體45mL×1瓶,4℃保存;
試劑二:粉劑×1支,-20℃保存;
試劑三:粉劑×1支,-20℃保存;臨用前加入1.5mL雙蒸水充分溶解備用,用不完的試劑仍-20℃保存;
試劑四:液體×1支,4℃保存;臨用前每支加入900μL雙蒸水充分溶解備用,用不完的試劑仍4℃保存;
PK工作液的配制:臨用前將試劑二轉(zhuǎn)移至試劑一中,充分溶解待用。
樣本的前處理
1、細(xì)菌或細(xì)胞處理:收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照每200萬細(xì)菌或細(xì)胞加入400μL提取液,超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(功率200W,工作3s,間歇10s,工作35次),8000g,4℃,離心10min,取上清,置冰上待測。
2、組織處理:稱取約0.1g組織,加入1mL提取液進(jìn)行冰浴勻漿;8000g ,4℃,離心10min,取上清,置冰上待測。
3、血清(漿)樣品:直接檢測。
測定步驟
試劑名稱(μL) | 測定管 |
PK工作液 | 900 |
試劑三 | 30 |
試劑四 | 15 |
混勻,37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)水浴5min
樣本 | 30 |
將上述試劑按順序加入1 mL石英比色皿中,加樣本的同時(shí)開始計(jì)時(shí),在340nm波長下記錄20秒時(shí)的初始吸光度A1,比色后迅速將比色皿連同反應(yīng)液一起放入37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)2分鐘;迅速取出比色皿并擦干,340 nm下比色,記錄2分20秒時(shí)的吸光度A2,計(jì)算ΔA=A1-A2。
注意事項(xiàng)
1、測定過程中樣本和所有試劑在冰上放置,以免變性和失活。
2、比色皿中反應(yīng)液的溫度必須保持37℃或25℃,取小燒杯一只裝入一定量的37℃或25℃蒸餾水,將此燒杯放入37℃或25℃水浴鍋中。在反應(yīng)過程中把比色皿連同反應(yīng)液放在此燒杯中。
3、兩個(gè)人同時(shí)做此實(shí)驗(yàn),一個(gè)人比色,一個(gè)人計(jì)時(shí),以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。
丙酮酸激酶(PK)檢測試劑盒
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