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描述:測(cè)定原理:AH催化苯胺羥化后產(chǎn)生的4-氨基酚,進(jìn)一步轉(zhuǎn)變?yōu)榉?吲哚復(fù)合物,在630nm處有特征吸收峰;通過(guò)測(cè)定630nm吸光度增加速率,來(lái)計(jì)算AH活性。苯胺-4羥化酶(AH)檢測(cè)試劑盒
標(biāo)題:苯胺-4羥化酶(AH)檢測(cè)試劑盒
產(chǎn)品概述
苯胺-4羥化酶(AH)檢測(cè)試劑盒
測(cè)定意義:
細(xì)胞色素P450酶是一組主要存在于肝臟的同工酶,在外源物質(zhì)代謝中具有重要作用,尤其是藥物和毒物的代謝。AH在P450酶系中相當(dāng)于CYP2E1亞型,CYP2E1不僅參與了藥物的代謝,而且還能催化多種前致癌物和前毒物的活化過(guò)程。
自備儀器和用品:
酶標(biāo)儀、普通離心機(jī),低溫超速離心機(jī)、可調(diào)式移液槍、酶標(biāo)板和冰。
試劑組成和配置:
試劑一:粉劑×1瓶,4℃保存。臨用前加入100 mL蒸餾水,充分溶解。
試劑二:液體×1瓶,4℃保存。
試劑三:粉劑×1瓶,4℃保存。臨用前加入10 mL蒸餾水,充分溶解。
試劑四:粉劑×1瓶,4℃保存。臨用前加入2600 μL蒸餾水,充分溶解。
試劑五:粉劑×1瓶,4℃保存。臨用前加入10 mL蒸餾水,充分溶解。
試劑六:粉劑×1瓶(腐蝕性試劑),4℃避光保存。臨用前加入5mL蒸餾水,充分溶解。
試劑七:粉劑×1瓶,4℃保存。臨用前加入5 mL蒸餾水,充分溶解。
標(biāo)準(zhǔn)液:液體×1瓶,10μmol/L,4℃避光保存。
粗酶液提?。?/span>
1. 除去細(xì)胞核和線粒體等:稱約0.2 g組織,加入4℃預(yù)冷的500 μ L試劑一,冰上充分研磨,10 000g 4℃離心30min,取上清液,轉(zhuǎn)移到超速離心管中。
2. 粗制微粒體:4℃,100 000g,離心60min,棄上清液。
3. 除血紅蛋白等雜質(zhì):向步驟2的沉淀中加500 μ L試劑一,蓋緊后充分震蕩溶解,100 000g離心30min,棄上清液。
4. 終微粒體:向步驟3的沉淀中加試劑二200 μ L,蓋緊后充分震蕩溶解,4℃保存待測(cè)。
測(cè)定:
1. 酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到630 nm,蒸餾水調(diào)零。
2. 試劑三置于37℃水浴中預(yù)熱30min以上。
3. 試劑五置于冰浴預(yù)冷30min以上。
4. 標(biāo)準(zhǔn)孔:在酶標(biāo)板標(biāo)準(zhǔn)孔中,依次加入100μL 標(biāo)準(zhǔn)液,50μL試劑六,50μL試劑七,混勻后室溫靜置30min,于630 nm測(cè)定光吸收,記為A標(biāo)準(zhǔn)孔。
5. 空白孔:取1支0.5 mL EP管,加入50μL粗酶液,100μL試劑三,50μL蒸餾水,混勻后37℃水浴中保溫30min;再加入100μL試劑五,混勻后冰浴5min,11000rpm,4℃,離心10min;在酶標(biāo)板空白孔中依次加入100μL上清液,50μL試劑六,50μL試劑七,混勻后室溫靜置30min,于630 nm測(cè)定光吸收,記為A空白管。
6. 測(cè)定孔:取1支0.5 mL EP管,加入50μL粗酶液,100μL試劑三,50μL試劑四,混勻后37℃水浴中保溫30min;再加入100μL試劑五,混勻后冰浴5min,11000rpm,4℃,離心10min;在酶標(biāo)板空白孔中依次加入100μL上清液,50μL試劑六,50μL試劑七,混勻后室溫靜置30min,于630 nm測(cè)定光吸收,記為A空白管。
苯胺-4羥化酶(AH)檢測(cè)試劑盒
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