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描述:測(cè)定原理:NAD-ME催化NAD+還原成NADH,在340nm下測(cè)定NADH增加速率。NAD-蘋(píng)果酸酶(NAD-ME)檢測(cè)試劑盒
標(biāo)題:NAD-蘋(píng)果酸酶(NAD-ME)檢測(cè)試劑盒
產(chǎn)品概述
NAD-蘋(píng)果酸酶(NAD-ME)檢測(cè)試劑盒
測(cè)定意義:
ME廣泛存在于微生物、培養(yǎng)細(xì)胞、動(dòng)物和植物胞漿中,尤其在植物組織中活性較高。ME催化蘋(píng)果酸氧化脫羧的可逆反應(yīng),產(chǎn)生丙酮酸和CO2,以及伴隨NAD(P)+的還原反應(yīng),是蘋(píng)果酸代謝的關(guān)鍵酶。ME活性與生物合成和抗氧化密切相關(guān)。近年來(lái)植物ME活性測(cè)定較多,已經(jīng)成為抗氧化研究的熱點(diǎn)。根據(jù)輔酶專(zhuān)一性和對(duì)底物特異性的不同,可將ME分為NAD-ME(EC1.1.1.38)和NADP-ME(EC1.1.1.40)。
需自備的儀器和用品:
紫外分光光度計(jì)、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1 mL石英比色皿和蒸餾水。
試劑的組成和配制:
提取液:60mL×1瓶,4℃保存。;
試劑一:液體40mL×1瓶,4℃保存;
試劑二:液體20mL×1瓶,4℃保存;
試劑三:粉劑×2支,4℃保存;用時(shí)每支加1mL雙蒸水充分溶解備用;
試劑四:粉劑×2支,-20℃保存;用時(shí)每支加500μL雙蒸水充分溶解備用。
樣本的前處理:
1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備 :
細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞:先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),棄上清,按照每200萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入400μL提取液,超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(功率20%,超聲3s,間隔10s,重復(fù)30次)。8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測(cè)。
組織:稱(chēng)取約0.1g組織,加入1mL提取液進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測(cè)。
2、血清(漿)樣品:直接檢測(cè)。
測(cè)定操作表:
試劑名稱(chēng)(μL) | 測(cè)定管 |
試劑一 | 600 |
試劑二 | 225 |
試劑三 | 30 |
試劑四 | 15 |
樣本 | 30 |
將上述試劑按順序加入1 mL石英比色皿中,混勻后在37℃(哺乳動(dòng)物)或25℃(其它物種),340 nm波長(zhǎng)下記錄初始吸光度A1和反應(yīng)1min后的吸光度A2,計(jì)算ΔA=A2-A1。
注意事項(xiàng):
1、若A2-A1大于0.5,需將酶液用提取液稀釋?zhuān)?/span>A2-A1小于0.5,可提高檢測(cè)靈敏度。
2、實(shí)驗(yàn)時(shí),試劑三、試劑四和樣本在冰上放置,以免變性和失活。試劑一37℃或25℃水浴放置。
3、比色皿中反應(yīng)液的溫度必須保持37℃或25℃,取小燒杯一只裝入一定量的37℃或25℃蒸餾水,將此燒杯放入37℃或25℃水浴鍋中。在反應(yīng)過(guò)程中把比色皿連同反應(yīng)液放在此燒杯中。
4、兩個(gè)人同時(shí)做此實(shí)驗(yàn),一個(gè)人比色,一個(gè)人計(jì)時(shí),以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。
NAD-蘋(píng)果酸酶(NAD-ME)檢測(cè)試劑盒
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