四種常見ELISA方法
1.直接ELISA
將抗原固定于ELISA板上,然后用酶標抗體直檢測抗原。
相較于其它類型的ELISA實驗,直接ELISA實驗步驟少,檢測速度快,不需要用到二抗,避免了交叉反應,測定結果不容易出錯。但是由于直接ELISA的抗原不是特異性固定的,樣本中的靶蛋白及其他雜質(zhì)蛋白都會與ELISA板結合,實驗背景會比較高。而且直接ELISA每種靶蛋白都需要準備能夠與其特異性結合的一抗,實驗不太靈活。另外由于沒有使用二抗,信號沒有被放大,降低了測定的靈敏度。
2.間接ELISA
先將抗原結合到ELISA板上,隨后分兩步進行檢測:首先加入檢測抗體與抗原特異性結合,隨后加入酶標二抗檢測并利用底物顯色。
與直接ELISA相比,間接ELISA用到酶標二抗,具有更高的靈敏度,也需要更少的標記抗體,更經(jīng)濟。間接ELISA還提供了更大的靈活性,因為不同的一抗能夠與單一標記的二抗一同使用。間接ELISA實驗的缺點是存在交叉反應的可能性(酶標二抗直接與抗原結合),可能會增加背景,同時與直接ELISA相比,間接ELISA實驗多了二抗孵育的步驟,實驗周期延長。
3.夾心ELISA
先將捕獲抗體固定于ELISA板孔中,然后加入樣品,接著加入檢測抗體。如果檢測抗體是酶標抗體,則可稱為直接夾心ELISA;如果檢測抗體不帶有標記,則還需要使用酶標二抗與檢測抗體結合,這種稱為間接夾心ELISA。
夾心ELISA的靈敏度高,它比直接或間接ELISA敏感2-5倍;同時夾心ELISA使用兩種特異性抗體與抗原結合,擁有很高的特異性。另外夾心ELISA能夠通過直接或間接的方式進行檢測,靈活性較高。夾心ELISA的缺點是對配對抗體要求很高,如果沒有標準化的試劑盒或者已經(jīng)通過測試的配對抗體,則需要進行配對抗體定制并進行優(yōu)化,因為降低捕獲抗體與檢測抗體之間的交叉反應是非常重要的。
4.競爭ELISA法
預先將抗原包被在固相載體上,并加入酶標記的特異性抗體。實驗時,加入待檢抗原(或抗體),如果待檢物是抗原,則待檢抗原與預先包被在固相載體上的抗原競爭結合酶標抗體;如果待檢測物是抗體,則待檢抗體就與系統(tǒng)中原有的酶標抗體競爭結合包被在固相載體上的抗原。通過洗滌洗掉被競爭結合的酶標抗體,最后加底物顯色。需要注意的是顯色結果與待檢抗原(或抗體)的量成反比。
競爭ELISA相對以上介紹的三種方法更復雜一些,但以上三種ELISA類型都適用于競爭ELISA的形式。其主要優(yōu)點在于可檢測不純的樣品,且數(shù)據(jù)再現(xiàn)性高,但存在整體敏感性和專一性較差的問題。
常見ELISA試劑盒系列IL-1、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-2R、IL-27、IL-23、IL-17、IL-18、IL-9、IL-8、IL-6、IL-5、IL-4、IL-2、IL-13、IL-11、IL-10、IL-12P70、IL-12P40、IFN-ω、IFN-β、IFN-α、 IFN-γ、TNF-β、TNF-α、sICAM-1、LEP、MMP-3等
大鼠常見ELISA試劑盒系列大鼠:TNF-α、IL-1β、IL-7、IL-32、IL-21、IL-27、IL-23、IFN-γ、TGF-α、TGF-β1等
小鼠常見ELISA試劑盒系列小鼠:IFN-γ、IL-1α、IL-1β、IL-13、IL-10、IL-11、IL-17、TNF-α、TNF-β、VEGF、TGF-β1等