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ELISA常見問題與解決方法
1. 陰性對照出現(xiàn)陽性結(jié)果
① 樣品、試劑被污染,或加樣時操作不當導(dǎo)致相鄰孔之間溶液濺灑出現(xiàn)交叉污染——更換試劑,小心操作。
② 酶標板洗滌不徹底——洗板前先將抗體溶液倒干凈,然后清洗液倒?jié)M板孔,確保能充分洗滌。
③ 抗體量過多導(dǎo)致非特異性結(jié)合——根據(jù)說明書的推薦量使用抗體,稀釋抗體到適當濃度。
2.酶標板整體背景高
① 抗體非特異性結(jié)合——應(yīng)確保板孔進行了封閉并且使用的是恰當?shù)姆忾]液以防止非特異性結(jié)合。
② 底物結(jié)合濃度過高——對底物進行適當稀釋。
③ 反應(yīng)時間過長——當酶標板顯色足夠進行吸光度讀數(shù)時立即使用終止液終止反應(yīng),適當縮短顯色時間。
④ 底物溶液污染——正常底物溶液應(yīng)是澄清透明的,若出現(xiàn)黃色或其他顏色表明受到污染,應(yīng)更換新的底物溶液。
⑤ 底物孵育過程沒有避光——底物孵育應(yīng)在避光條件下進行。
3. 復(fù)孔之間重復(fù)性差
① 樣品數(shù)量不整齊,加樣時間有長有短——加重復(fù)孔時盡量保持加樣時間與第一次接近。
② 加樣量不一致——樣品稀釋前應(yīng)充分混勻,并且使用同一移液槍。
③ 洗滌條件、操作人員不一致——重復(fù)測定樣品時,操作條件、人員應(yīng)盡可能與上次保持一致。
4. 吸光值偏高或偏低
① 樣品中待測抗原含量太低會導(dǎo)致測定結(jié)果偏低——可嘗試增加樣品使用量。
② 加入抗體量不合適會造成結(jié)果偏低或偏高——使用建議抗體量或為了使結(jié)果更好盡可能調(diào)整抗體的最適用量。
③ 孵育時間太短導(dǎo)致檢測結(jié)果偏低——適當延長抗體或抗原的孵育時間,確保待測樣品與檢測抗體能充分結(jié)合。
④ 孵育溫度不適合——應(yīng)保證抗體在最適宜條件下進行孵育(一般37℃孵育1h)。
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