描述:測定意義:細胞色素P450酶是一組在外源物質代謝中,尤其是藥物和毒物,具有重要作用的酶系。AND作為P450酶系的重要一員,相當于CYP3A4亞型,與藥物的去甲基化反應密切相關。測定原理:AND催化氨基比林釋放甲醛,通過Nash比色法測定甲醛含量,即可計算出AND活性。氨基比林-N-去甲基化酶(AND)檢測試劑盒
標題:氨基比林-N-去甲基化酶(AND)檢測試劑盒
產品概述
氨基比林-N-去甲基化酶(AND)檢測試劑盒
自備儀器和樣品:
可見分光光度計、普通離心機,超速離心機、水浴鍋、可調式移液槍、1mL玻璃比色皿、蒸餾水、無水乙醇和冰。
試劑組成和配制:
試劑一:粉劑×1瓶,4℃保存。臨用前加100mL蒸餾水充分溶解。
試劑二:液體×1瓶,4℃保存。
試劑三:粉劑×1瓶(棕色瓶),4℃避光保存。臨用前加入1050 μ L無水乙醇,充分溶解。
試劑四:粉劑×1瓶,4℃保存。臨用前加入510 μ L蒸餾水,充分溶解。
試劑五:粉劑×1瓶,室溫保存。臨用前加3600μ L蒸餾水,充分溶解。
試劑六:液體×1瓶,室溫保存。
試劑七:液體×1瓶,4℃保存。
標準液:液體×1瓶,-20℃保存。臨用前取1.5 mL EP 管,加入10 μ L標準液,加990 μ L蒸餾水,混勻即為50μmol/L標準甲醛溶液,4℃保存。
粗酶液提?。?/span>
1、除去細胞核,線粒體等大分子物質:稱約0.2 g組織,加入500μL試劑一,冰上充分研磨,10 000g 4℃離心30min,取上清液轉入超速離心管。
2、粗制微粒體:4℃,100 000g,離心60min,棄上清液。
3、除血紅蛋白等雜質:向步驟2的沉淀中加500μL試劑一,蓋緊后充分震蕩溶解,100 000g離心30min,棄上清液。
4、終微粒體:向步驟3的沉淀中加試劑二200μL,蓋緊后充分震蕩溶解,即粗酶液,待測。該待測液需當天使用。
測定:
1. 分光光度計預熱30 min以上,調節(jié)波長到412 nm,蒸餾水調零。
2. 試劑二置于37℃水浴中預熱30min以上。
3. 空白孔:取1支EP管,加入10μL粗酶液,170μL試劑二,10μL試劑三,10μL蒸餾水,混勻后置于37℃水浴保溫30min;立即加入35μL試劑五,混勻后置于冰浴中5min;取出后加入35μL試劑六,混勻后室溫靜置5min;室溫8000rpm離心5min;取新的EP管,加入100μL上清液,100μL試劑七,混勻后60℃水浴10min,然后取出,用冷水冷卻5min,于412nm測定光吸收,記為A空白管。每個樣品都需要做空白管。
4. 測定孔:取1支EP管,加入10μL粗酶液,170μL試劑二,10μL試劑三,10μL試劑四,混勻后置于37℃水浴保溫30min;立即加入35μL試劑五,混勻后置于冰浴中5min;取出后加入35μL試劑六,混勻后室溫靜置5min;室溫8000rpm離心5min;取1支新EP管,加入100μL上清液,100μL試劑七,混勻后60℃水浴10min,然后取出,用冷水冷卻5min,加入測定孔,于412nm測定光吸收,記為A測定管。
5. 標準孔:取1支EP管,加入100μL標準品,100μL試劑七,混勻后60℃水浴10min,然后取出,用冷水冷卻5min,加入標準孔,于412nm測定光吸收,記為A標準管。
氨基比林-N-去甲基化酶(AND)檢測試劑盒
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