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α酮戊二酸脫氫酶(α-KGDH)檢測(cè)試劑盒

描述:測(cè)定意義
α-KGDH(EC 1.2.4.2)廣泛存在于動(dòng)物、植物微生物和培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體中,是三羧酸循環(huán)調(diào)控關(guān)鍵酶之一,催化α-酮戊二酸氧化脫羧生成琥珀酰輔酶A。
測(cè)定原理
α-KGDH催化α-酮戊二酸、NAD+ 和輔酶A生成琥珀酰輔酶A、 二氧化碳和 NADH,NADH在340 nm有特征吸收峰,以NADH的生成速率表示α-KGDH活性。
α酮戊二酸脫氫酶(α-KGDH)檢測(cè)試劑盒

  • 產(chǎn)品型號(hào):
  • 廠商性質(zhì):生產(chǎn)廠家
  • 更新時(shí)間:2019-11-07
  • 訪問量:490
產(chǎn)品詳情/ PRODUCT DETAIL

標(biāo)題:α酮戊二酸脫氫酶(α-KGDH)檢測(cè)試劑盒

產(chǎn)品概述

α酮戊二酸脫氫酶(α-KGDH)檢測(cè)試劑盒

需自備的儀器和用品

紫外分光光度計(jì)、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1mL石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制

試劑一:50mL×1瓶,-20保存;

試劑二:10mL×1瓶,-20保存;

試劑三:1mL×1支,-20保存;

試劑四:液體55.5mL×1瓶,4保存;

試劑五:粉劑×1支,4保存;

試劑六:粉劑×1支,4保存;

試劑七:粉劑×1支,4保存;

試劑八:粉劑×1支,4保存;

試劑九:粉劑×1支,-20保存;

試劑十:粉劑×1支,-20保存;臨用前加入2.1mL雙蒸水充分混勻待用,用不完的試劑仍-20保存。

工作液的配制:臨用前把試劑五、試劑六、試劑七、試劑八和試劑九轉(zhuǎn)移到試劑四中混合溶解待用。

α-KGDH的提取

  1. 準(zhǔn)確稱取約0.1g組織或收集約500萬細(xì)胞,加入1mL試劑一和10uL 試劑三,用冰浴勻漿器或研缽勻漿。
  2. 4 600 g離心5min。
  3. 棄沉淀,將上清液移至另一離心管中,4 11000 g離心10min。
  4. 上清液即胞漿提取物,可用于測(cè)定從線粒體泄漏的α-KGDH(此步可選做)。
  5. 在沉淀中加入200uL試劑二和2uL 試劑三,超聲波破碎(功率20%,超聲3秒,間隔10秒,重復(fù)30次),用于線粒體α-KGDH活性測(cè)定。

測(cè)定步驟

  1. 調(diào)零

用蒸餾水于340nm處調(diào)零。

1)取1.1mL工作液加入1mL石英比色皿,在37(哺乳動(dòng)物)或25(其它物種)孵育5min。

2)取出比色皿,再依次加入40μL試劑十和60μL樣本,混勻;加入樣本的同時(shí)開始計(jì)時(shí),立即記錄340nm20s的吸光值A137(哺乳動(dòng)物)或25(其它物種)中準(zhǔn)確反應(yīng)2min,記錄340nm2min20s時(shí)的吸光值A2,計(jì)算ΔA=A2-A1。

注意事項(xiàng)

1、測(cè)定過程中所有試劑和樣本在冰上放置,以免變性和失活。

2、比色皿中反應(yīng)液的溫度必須保持3725,取小燒杯一只裝入一定量的3725蒸餾水,將此燒杯放入3725水浴鍋中。在反應(yīng)過程中把比色皿連同反應(yīng)液放在此燒杯中。

3、兩個(gè)人同時(shí)做此實(shí)驗(yàn),一個(gè)人比色,一個(gè)人計(jì)時(shí),以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

α酮戊二酸脫氫酶(α-KGDH)檢測(cè)試劑盒

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