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P產(chǎn)品分類RODUCT CATEGORY
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描述:測定意義:Na+K+- ATP酶廣泛分布于植物、動物、微生物和細(xì)胞中,可催化ATP水解生成ADP和無機(jī)磷Na+k+——ATP酶檢測試劑盒
標(biāo)題:Na+k+——ATP酶檢測試劑盒
產(chǎn)品概述
Na+k+——ATP酶檢測試劑盒
需自備的儀器和用品:
可見分光光度計(jì)、水浴鍋、臺式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1mL玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配制:
提取液:液體50mL×1 瓶,4℃保存。
試劑一:液體 10mL×1 瓶,4℃保存。
試劑二:液體 5mL×1 瓶,4℃保存。
試劑三:液體 5ml×1 瓶,4℃保存。
試劑四:粉劑×3 支,-20℃保存。用時(shí)每支加1mL蒸餾水,現(xiàn)用現(xiàn)配。用不完的試劑-20℃可保存一周。
試劑五:液體 5mL×1 瓶,4℃保存。
試劑六:粉劑×1 瓶,4℃保存。用時(shí)加入3mL雙蒸水, 4℃保存。
試劑七:粉劑×1瓶, 4℃保存。用時(shí)加入25mL雙蒸水,溶解后4℃保存一周。
試劑八:粉劑×1瓶, 4℃保存。用時(shí)加入25mL雙蒸水,溶解后4℃保存一周。
試劑九: 液體 25mL×1 瓶,室溫保存。
試劑十:10mmol/L 標(biāo)準(zhǔn)磷貯備液 10mL×1 瓶,4℃保存。
0.5μmol/mL 標(biāo)準(zhǔn)磷應(yīng)用液配制:將貯備液 20倍稀釋,即取 0.1mL試劑十加1.9mL蒸餾水充分混勻。
定磷劑的配制:按H2O: 試劑七:試劑八:試劑九=2:1:1:1 的比例配制,配好的定磷劑應(yīng)為淺黃色。若無色則試劑失效,若是藍(lán)色則為磷污染,定磷劑現(xiàn)用現(xiàn)配。
樣品酶液的制備:
1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備:
細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞:先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照每500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液,超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(功率20%,超聲3s,間隔10s,重復(fù)30次);8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
組織:稱取約0.1g組織,加入1mL提取液進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
2、血清(漿)樣品:直接檢測。
操作步驟
1、分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至660nm,蒸餾水調(diào)零。
2、酶促反應(yīng)(在EP管中加入下列試劑)
| 對照管 | 測定管 |
試劑一(μL) | 130 | 90 |
試劑二(μL) | 40 | 40 |
試劑三(μL) | 40 | 40 |
試劑四(μL) | 40 | 40 |
試劑五(μL) |
| 40 |
樣品 (μL) |
| 200 |
混勻,37℃(哺乳動物)或25℃(其他物種)準(zhǔn)確水浴10min
試劑六(μL) | 50 | 50 |
樣品(μL) | 200 |
|
混勻,4000g,常溫離心10min,取上清液
3定磷(在1.5mLEP管中依次加入下列試劑)
| 空白管 | 標(biāo)準(zhǔn)管 | A管 | B管 |
0.5μmol/ml標(biāo)準(zhǔn)磷應(yīng)用液(μL) |
| 100 |
|
|
上清液(μL) |
|
| 100 | 100 |
蒸餾水(μL) | 100 |
|
|
|
定磷試劑(μL) | 1000 | 1000 | 1000 | 1000 |
混勻,37℃水浴 30 min,冷卻至室溫,在 660nm處比色。
注意:
1、A管為對照管;B管為Na+K+-ATP酶測定管;
2、由于每一個(gè)樣都必須做對照,本試劑盒50管保證測 24份Na+K+-ATP酶。
3、此法具有微量、靈敏、快速的特點(diǎn)。所以對測定所用試管要求嚴(yán)格無磷。
4、空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只要做一管。
Na+k+——ATP酶檢測試劑盒
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