標題：Ca++Mg++——ATP酶檢測試劑盒

產品概述

Ca++Mg++——ATP酶檢測試劑盒

需自備的儀器和用品:

可見分光光度計、水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、1mL玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

提取液：液體50mL×1 瓶，4℃保存。

試劑一：液體 10mL×1 瓶，4℃保存。

試劑二：液體 5mL×1 瓶，4℃保存。

試劑三：液體 5ml×1 瓶，4℃保存。

試劑四：粉劑×3 支，-20℃保存。用時每支加1mL蒸餾水，現用現配。用不完的試劑-20℃可保存一周。

試劑五：液體 5mL×1 瓶，4℃保存。

試劑六：粉劑×1 瓶，4℃保存。用時加入3mL雙蒸水， 4℃保存。

試劑七：粉劑×1瓶, 4℃保存。用時加入25mL雙蒸水，溶解后4℃保存一周。

試劑八：粉劑×1瓶, 4℃保存。用時加入25mL雙蒸水，溶解后4℃保存一周。

試劑九： 液體 25mL×1 瓶，室溫保存。

試劑十：10mmol/L 標準磷貯備液 10mL×1 瓶，4℃保存。

0.5μmol/mL 標準磷應用液配制：將貯備液 20倍稀釋，即取 0.1mL試劑十加1.9mL蒸餾水充分混勻。

定磷劑的配制：按H2O: 試劑七:試劑八:試劑九=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷劑應為淺黃色。若無色則試劑失效，若是藍色則為磷污染，定磷劑現用現配。

樣品酶液的制備：

1、細菌、細胞或組織樣品的制備：

細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照每500萬細菌或細胞加入1mL提取液，超聲波破碎細菌或細胞（功率20％，超聲3s，間隔10s，重復30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

組織：稱取約0.1g組織，加入1mL提取液進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2、血清（漿）樣品：直接檢測。

操作步驟

1、分光光度計預熱30min以上，調節(jié)波長至660nm，蒸餾水調零。

2、酶促反應（在EP管中加入下列試劑）

混勻，37℃（哺乳動物）或25℃（其他物種）準確水浴10min

混勻，4000g，常溫離心10min，取上清液

3定磷(在1.5mLEP管中依次加入下列試劑)

混勻，37℃水浴 30 min，冷卻至室溫，在 660nm處比色。

注意：

1、A管為對照管；B管為Na⁺K⁺-ATP酶測定管；

2、由于每一個樣都必須做對照，本試劑盒50管保證測 24份Na⁺K⁺-ATP酶。

3、此法具有微量、靈敏、快速的特點。所以對測定所用試管要求嚴格無磷。

4、空白管和標準管只要做一管。

計算

1、血清（漿）Na⁺K⁺-  ATPase活力的計算:

定義：規(guī)定每小時每毫升血清（漿）中Na⁺K⁺- ATP 酶分解ATP 產生1μmol無機磷的量為一個酶活力單位。

Na⁺K⁺-ATP酶活力（U/mL）= C標準管×（A測定管-A對照管）÷（A標準管-A空白管）×V總÷V樣÷T=7.5×（A測定管-A對照管）÷（A標準管-A空白管）

組織中Na⁺K⁺-  ATPase的計算：

2、組織、細菌或細胞中Na⁺K⁺- ATPase活力的計算：

（1）按蛋白濃度計算：

定義：規(guī)定每小時每毫克組織蛋白中Na⁺K⁺- ATP 酶分解ATP 產生1μmol無機磷的量為一個酶活力單位。

Na⁺K⁺-ATP酶活力(U/mg)= C標準管×（A測定管-A對照管）÷（A標準管-A空白管）×V總÷（Cpr×V樣）÷T =7.5×（A測定管-A對照管）÷（A標準管-A空白管）÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算：

定義：規(guī)定每小時每克組織中Na⁺K⁺-ATP 酶分解ATP 產生1μmol無機磷的量為一個酶活力單位。

Na⁺K⁺-ATP酶活力(U/g)= C標準管×（A測定管-A對照管）÷（A標準管-A空白管）×V總÷(V樣÷V樣總×W)÷T=7.5×（A測定管-A對照管）÷（A標準管-A空白管）÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

定義：規(guī)定每小時每1萬個細菌或細胞中Na⁺K⁺-ATP 酶分解ATP 產生1μmol無機磷的量為一個酶活力單位。

Na⁺K⁺-ATP酶活力(U/10⁴)= C標準管×（A測定管-A對照管）÷（A標準管-A空白管）×V總÷(V樣÷V樣總×500)÷T=0.015×（A測定管-A對照管）÷（A標準管-A空白管）

C標準管：標準管濃度，0.5μmol/mL；V總：酶促反應總體積，0.5mL；V樣：加入樣本體積，0.2mL ；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應時間，1/6小時；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本鮮重，g；500：細菌或細胞總數，500萬。

Ca++Mg++——ATP酶檢測試劑盒