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CCK試劑盒實驗中的小技巧,你學會了嗎
Cell Counting Kit簡稱 CCK 試劑盒,為MTT法的替代方法,是一種基于WST(水溶性四唑鹽,化學名:2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽)的廣泛應用于細胞增殖和細胞毒性的快速高靈敏度檢測試劑盒。
細胞活性檢測
1、在96孔板中接種細胞懸液(100μL/孔)。將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中預培養(yǎng)(在37℃,5% CO2的條件下)。
2、向每孔加入10 μL的CCK溶液(注意不要在孔中生成氣泡,它們會影響OD值的讀數(shù))。
3、將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內孵育1-4小時。
4、用酶標儀測定在450nm處的吸光度。
5、如果暫時不測定OD值,打算以后測定的話,可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液,并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。在24小時內吸光度不會發(fā)生變化。
細胞增值-毒性檢測
1、在96孔板中配置100μL的細胞懸液。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱預培養(yǎng)24小時(在37℃,5% CO2的條件下)。
2、向培養(yǎng)板加入10μL不同濃度的待測物質。
3、將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育一段適當?shù)臅r間(例如:6、12、24或48小時)。
4、向每孔加入10μL CCK溶液(注意不要再孔中生成氣泡,它們會影響OD值的讀數(shù))。
5、將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內孵育1-4小時。
6、用酶標儀測定在450nm處的吸光度。
7、如果暫時不測定OD值,打算以后測定的話,可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液,并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。在24小時內吸光度不會發(fā)生變化。
注意:如果待測物質有氧化性或還原性的話,可在加CCK之前更換新鮮培養(yǎng)基(除去培養(yǎng)基,并用培養(yǎng)基洗滌細胞兩次,然后加入新的培養(yǎng)基),去掉藥物影響。當然藥物影響比較小的情況下,可以不更換培養(yǎng)基,直接扣除培養(yǎng)基中加入藥物后的空白吸收即可。
實驗小技巧:
①建議先做幾個孔摸索接種細胞的數(shù)量和加入CCK試劑后的培養(yǎng)時間。
②有條件的情況下建議采用多通道移液器,可以減少平行孔減的差異。加入CCK試劑時,建議斜貼著培養(yǎng)板壁加,不要插到培養(yǎng)基頁面下加,容易產生氣泡,會干擾OD值讀數(shù)。
③白細胞可能需要培養(yǎng)較長時間。
④當使用標準96孔板時,貼壁細胞的小接種量至少為1,000 個/孔 (100 μL 培養(yǎng)基)。檢測白細胞時的靈敏度相對較低,因此推薦接種量不低于2,500 個/孔 (100 μL 培養(yǎng)基)。如果要使用24孔板或6孔板實驗,請先計算每孔相應的接種量,并按照每孔培養(yǎng)基總體積的10%加入CCK溶液。
CCK試劑盒實驗中的小技巧,你學會了嗎
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