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描述:測(cè)定意義HK(EC 2.7.1.1)廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中,是葡萄糖分解過程中的*個(gè)關(guān)鍵酶,催化葡萄糖轉(zhuǎn)化為6-磷酸葡萄糖,6-磷酸葡萄糖是糖酵解和磷酸戊糖途徑的交叉點(diǎn)。己糖激酶(HK)檢測(cè)試劑盒
標(biāo)題:己糖激酶(HK)檢測(cè)試劑盒
產(chǎn)品概述
己糖激酶(HK)檢測(cè)試劑盒
測(cè)定原理
HK催化葡萄糖合成6-磷酸葡萄糖,6-磷酸葡萄糖脫氫酶進(jìn)一步催化6-磷酸葡萄糖脫氫生成NADPH,NADPH在340nm有特征吸收峰。
需自備的儀器和用品
紫外分光光度計(jì)、恒溫水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1 mL石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配制
提取液:60mL×1瓶,4℃保存;
試劑一:液體30mL×1瓶, 4℃保存;
試劑二:液體30mL×1瓶,4℃保存;
試劑三:液體5 mL×1瓶,4℃保存;
試劑四:粉劑×1支,-20℃保存,臨用前加入4mL雙蒸水充分溶解備用;用不完的試劑仍-20℃保存;
試劑五:粉劑×1支,-20℃保存;臨用前每支加入2mL雙蒸水充分溶解備用;用不完的試劑仍-20℃保存;
試劑六:粉劑×1支,-20℃保存;臨用前每支加入250μL試劑一和250μL雙蒸水充分溶解備用,用不完的試劑4℃保存;
樣本的前處理
1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備
收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照每200萬細(xì)菌或細(xì)胞加入400μL提取液,超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(功率20%,超聲3s,間隔10s,重復(fù)30次);8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測(cè)。
稱取約0.1g組織,加入1mL提取液進(jìn)行冰浴勻漿;8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測(cè)。
2、血清(漿)樣品:直接檢測(cè)。
測(cè)定步驟
試劑名稱(μL) | 測(cè)定管 |
試劑一 | 400 |
試劑二 | 400 |
試劑三 | 80 |
試劑四 | 80 |
試劑五 | 40 |
試劑六 | 8 |
樣本 | 30 |
將上述試劑按順序加入1 mL石英比色皿中,加樣本的同時(shí)開始計(jì)時(shí),在340 nm波長(zhǎng)下記錄20秒時(shí)的初始吸光度A1,比色后迅速將比色皿連同反應(yīng)液一起放入37℃(哺乳動(dòng)物)或25℃(其它物種)水浴中,準(zhǔn)確反應(yīng)5分鐘。迅速取出比色皿并擦干,340 nm下比色,記錄5分20秒時(shí)的吸光度A2,計(jì)算ΔA=A2-A1。
注意事項(xiàng)
1、實(shí)驗(yàn)前,將試劑一、二、三37℃或25℃預(yù)熱10分鐘,之后37℃或25℃室溫放置。試劑四、五、六和樣本在冰上放置,以免變性和失活。
2、如果一次性測(cè)定樣本數(shù)較多,可將試劑一、二、三、四、五和六按比例配成混合液。
2、不同勻漿組織中HK活力不一樣,做正式試驗(yàn)之前請(qǐng)做1-2只預(yù)試,若A2-A1>1,則說明組織活力太高,必須用提取液稀釋成適當(dāng)濃度勻漿上清液,使A2-A1<1,以提高檢測(cè)靈敏度。
3、比色皿中反應(yīng)液的溫度必須保持37℃或25℃,取小燒杯一只裝入一定量的37℃25℃蒸餾水,將此燒杯放入37℃或25℃水浴鍋中。在反應(yīng)過程中把比色皿連同反應(yīng)液放在此燒杯中。
4、兩個(gè)人同時(shí)做此實(shí)驗(yàn),一個(gè)人比色,一個(gè)人計(jì)時(shí),以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。
己糖激酶(HK)檢測(cè)試劑盒
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