明膠酶譜分析試劑盒文獻(xiàn)支持，你還在猶豫嗎

簡(jiǎn)介：
基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)以無活性的酶原形式分泌，活化后能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)的膠原蛋白，又稱膠原酶。通過影響細(xì)胞外基質(zhì)，膠原酶參與胚胎發(fā)育、形態(tài)發(fā)生、組織重塑等過程，并參與炎癥、腫瘤、心血管、神經(jīng)等許多疾病過程。血漿與組織中的MMP-2、MMP-9參與各種生理與病理過程，其在臨床診斷和治療中的意義日益受到重視。

檢測(cè)原理：
本試劑盒采用酶譜法(Zymography)檢測(cè)MMP-2、MMP-9 活性。Zymography 是一種廣為使用的、基于SDS-PAGE 電泳和反相凝膠染色的蛋白酶檢測(cè)方法，其靈敏度可達(dá)1 nM，高于ELISA方法，其基本原理和程序是：制備加有膠原酶底物的SDS-PAGE 凝膠，含蛋白酶的樣品在此凝膠中進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后取出凝膠與酶反應(yīng)Buffer 孵育，凝膠染色與脫色。凝膠中由于含底物蛋白而被深染，形成深色背景，但在有蛋白酶條帶的位置，蛋白酶將降解凝膠中的底物蛋白，因而不被染色而形成透亮區(qū)域，從而能同時(shí)指示MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶譜)及活性。本試劑盒提供MMP-2、MMP-9 特異蛋白底物及酶學(xué)反應(yīng)緩沖液，可檢測(cè)少至0.1~0.5 μl 血液中的MMP-2、MMP-9 酶譜及活性，檢測(cè)靈敏度~1nM。試劑盒可進(jìn)行50次標(biāo)準(zhǔn)小膠檢測(cè)，如果小膠加樣孔為10~15個(gè)，則總計(jì)可檢測(cè)500~750個(gè)樣品。

實(shí)驗(yàn)小技巧：

實(shí)驗(yàn)過程中有出現(xiàn)透明條帶就說明試劑盒內(nèi)的底物等都是有活性的，試劑盒是沒有問題的。沒有MMP9和prommp2的條帶  可能是活性太低  不知道孵育了多久  另外這個(gè)實(shí)驗(yàn)對(duì)內(nèi)參定量沒有特別要求需要做

①、至于WB檢測(cè)有條帶，明膠酶譜檢測(cè)沒有條帶是這樣的，這兩種檢測(cè)方法原理都不相同。一個(gè)是檢測(cè)變性條件下解離的多肽，一個(gè)是活性檢測(cè)。不是說一個(gè)有條帶另一個(gè)一定能檢測(cè)出的。

②、關(guān)于出現(xiàn)其他條帶，最近我們也研究了，有2個(gè)解釋：一個(gè)就是酶家族其他成員，另一就是酶的降解產(chǎn)物。

③、全血檢測(cè)不出條帶，這個(gè)存在的原因也是多方面的，包括樣本和實(shí)驗(yàn)手法等等。結(jié)果一直檢測(cè)不出，我們也只是給出建議。有時(shí)候?qū)嶒?yàn)就是這樣，我們同樣的樣本，同一個(gè)人做實(shí)驗(yàn)，這次和下次的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能就*不同呢，不是說我們覺得它應(yīng)該是一樣的或者這個(gè)條帶該出來就一定出來的。

說明：
1. 10 mM 能夠EDTA*抑制MMP活性。
2. 凝膠干燥：可使用聚丙烯酰胺凝膠干膠裝置室溫快速干燥凝膠，作為記錄保留。

染色步驟：
1. 此染色液即為工作液，使用時(shí)直接將聚丙烯酰胺凝膠放在培養(yǎng)皿中以考馬斯亮藍(lán)染色液覆蓋凝
膠，并緩慢搖動(dòng)2h；
2. 傾去染色液，用脫色液沖洗凝膠；
3. 以脫色液覆蓋凝膠，緩慢搖動(dòng)2h，傾去脫色液，再加入新脫色液進(jìn)行脫色，直至獲得清晰的藍(lán)色的條帶和干凈的背景（通常此過程需要2～4h，也可脫色過夜至清晰的藍(lán)色的條帶和干凈的背景）；
4. 對(duì)凝膠進(jìn)行分析和照相，凝膠可放置在7％的乙酸中保存。也可用凝膠干膠裝置（P2000）對(duì)
凝膠進(jìn)行處理后保存。

參考文獻(xiàn)：
1. Nagase H and Woessner JF. Matrix Metalloproteinases. J Biol Chem, 1999, 274, 21491-21494
2. Heussen C, and Dowdle EB. Electrophoretic analysis of plasminogen activators in polyacrylamide
gels containing sodium dodecyl sulfate and copolymerized substrates. Anal. Biochem，1980, 102,196–202