Western Blotting實(shí)驗(yàn)檢測(cè)注意這幾點(diǎn)

1、收集蛋白樣品(Protein sample preparation)

可以使用適當(dāng)?shù)牧呀庖毫呀赓N壁細(xì)胞、懸浮細(xì)胞或組織樣品。對(duì)于某些特定的亞細(xì)胞組份蛋白，例如細(xì)胞核蛋白、細(xì)胞漿蛋白、線粒體蛋白等，可以參考相關(guān)文獻(xiàn)提取這些亞細(xì)胞組份蛋白，也可以使用試劑盒進(jìn)行抽提。

收集完蛋白樣品后，為確保每個(gè)蛋白樣品的上樣量一致，需要測(cè)定每個(gè)蛋白樣品的蛋白濃度。根據(jù)所使用的裂解液的不同，需要采用適當(dāng)?shù)牡鞍诐舛葴y(cè)定方法。因?yàn)椴煌牡鞍诐舛葴y(cè)定方法對(duì)于一些去垢劑和還原劑等的兼容性差別很大。如果使用北京博奧森生物技術(shù)公司生產(chǎn)的WIP細(xì)胞裂解液，可以使用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒。

2、電泳(Electrophoresis)

（1）、SDS-PAGE凝膠配制

SDS-PAGE凝膠可以參考一些文獻(xiàn)資料進(jìn)行配制，也可以使用博奧森生產(chǎn)的SDS-PAGE凝膠配制試劑盒。該試劑盒提供了除水和配膠器具外的所有試劑以及配制各種濃度SDS-PAGE的配方。

（2）、樣品處理

在收集的蛋白樣品中加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。使用5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液可以減小上樣體積，在相同體積的上樣孔內(nèi)可以上樣更多的蛋白樣品。5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液可以參考相關(guān)文獻(xiàn)資料配制，也可以使用博奧森生產(chǎn)的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5X) 。100℃或沸水浴加熱3-5分鐘，以充分變性蛋白。

（3）、上樣與電泳

冷卻到室溫后，把蛋白樣品直接上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi)即可。為了便于觀察電泳效果和轉(zhuǎn)膜效果，以及判斷蛋白分子量大小，最好使用預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)。

實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

1、 把聚丙烯酰胺凝膠中的蛋白質(zhì)電泳轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上；

a. 轉(zhuǎn)移緩沖液洗滌凝膠和硝酸纖維素膜，將硝酸纖維素膜鋪在凝膠上，用5ml移液管在凝膠上來回滾動(dòng)去除所有的氣泡

b. 在凝膠/濾膜外再包一張3mm濾紙（預(yù)先用轉(zhuǎn)移緩沖液浸濕），將凝膠夾在中間，保持濕潤和沒有氣泡

c. 將此濾紙/凝膠/薄膜濾紙按照廠家建議方法放入電泳裝置中，凝膠面向陰極

d. 將上述裝置放入緩沖液槽中，并灌滿轉(zhuǎn)移緩沖液以淹沒凝膠

e. 按照廠家所示接通電源開始電泳轉(zhuǎn)移

f. 轉(zhuǎn)移結(jié)束后，取出薄膜和凝膠，棄去凝膠

2、 將薄膜漂在氨基黑中快速染色，直至分子量標(biāo)準(zhǔn)顯現(xiàn)時(shí)取出，記錄下標(biāo)準(zhǔn)位置；

3、 用100ml水洗滌纖維素膜，必要時(shí)可用脫色緩沖液；

4、 膜置印跡緩沖液中于37℃保溫1小時(shí)；

5、 室溫下，用PBS-Tween緩沖液洗滌薄膜

6、 用封口機(jī)將薄膜封入塑料袋中，盡可能不留空氣；

7、 袋的一角剪一緩沖液的小口，用透析袋夾緊；