EZfusion 同源重組酶一站式解決所有問題。

EZfusion Enzyme 專門為把 PCR 產(chǎn)物快速、定向、有效的克隆到任何目標(biāo)載體而設(shè)計(jì)。有效的避免了在克隆過程中遇到的合適內(nèi)切酶的選擇、磷酸化、補(bǔ)平、加 A、使用中間載體等等一系列復(fù)雜步驟。無需連接酶，只需要把目標(biāo)載體線性化(平末端，粘性末端都可以)，PCR 產(chǎn)物無需任何酶促處理，直接和目標(biāo)載體混合，20-30 分鐘一站式解決所有問題。

技術(shù)原理：根據(jù)酶切后線性化載體的兩端序列，分別在目的基因兩端設(shè)計(jì) 15 base
與載體末端同源的序列，PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物兩端就會(huì)分別帶有 15bp 與線性化載體兩端相
同的序列。PCR 產(chǎn)物和線性化載體與 Ezfusion Enzyme 酶充分混勻。22℃溫浴 30min
后，按傳統(tǒng)方法轉(zhuǎn)化 E.coli competent cells,就可以高效、定向地將 PCR 產(chǎn)物克隆到目標(biāo)載體上。
 

操作步驟：
A. PCR 引引物設(shè)計(jì)及段準(zhǔn)備 物設(shè)計(jì)及片段準(zhǔn)備用該試劑盒克隆目的基因或者目標(biāo) DNA 段到的線性化載體，PCR 擴(kuò)增的引物外側(cè)必須有 10-18 個(gè)堿基與線性載體外側(cè)*配對(duì)?，F(xiàn)就 15 個(gè)堿基配對(duì)舉例

注意：公司的引物設(shè)計(jì)與 BD in-fusion kits 是不同的，使ÿ用ÿ公司的試劑僅使用上游10-18 個(gè)堿基和下游 10-18 個(gè)堿基作為附加堿基即可。可以采用任何聚合酶來得到 PCR 產(chǎn)物，但是，引物和引物二聚體會(huì)對(duì) Ezfusio 有一定的抑制作用。如果 PCR 反應(yīng)得到單一的目的條帶，PCR 產(chǎn)物可以用 PCR 純化試劑盒回收 ； 如果 PCR 產(chǎn)生很多非特異性條帶，應(yīng)該用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒去掉多余 條帶。

適用范圍：

（1） multiple fragments cloning and assembly. 
（2） cloning of any insert into any location of a chosen vector. 
（3） complete elimination of the dependence on availability of restrictionsites, phosphatase treatment and ligation. 
（4） inserts free from any redundant or unwanted base pairs. 
（5） save over 50% on reagent costs in comparison to other productsavailable on the market. 

B. 線性化載體的制備
載體的*線性化對(duì)于重組實(shí)驗(yàn)至關(guān)重要，沒有線性化的載體會(huì)產(chǎn)生非常高的背景。 線性化后的載體需要過柱純化或者凝膠回收純化。

C. 同源重組反應(yīng)的建立

D. 轉(zhuǎn)化
1. 新鮮制備的或-70℃下保存的 100ul 感受態(tài)細(xì)胞，置于冰上，*解凍后輕輕地
將細(xì)胞均勻懸浮。
2. 加入 10-12ul 連接液，輕輕混勻，冰上放置 30 分鐘。
3. 42℃水浴 90 秒，冰上放置 2 分鐘。
4. 加 600ul SOC 培養(yǎng)基，37℃ 250rpm 振蕩培養(yǎng) 1 小時(shí)。
5. 室溫下 4000rpm 離心 5 分鐘，用吸頭吸掉 500ul 上清液，用剩余的培養(yǎng)基將細(xì)
胞懸浮。
6. 將細(xì)菌均勻細(xì)致的涂布在 90mm 平板上。
注：細(xì)菌的用量依連接的效率及感受態(tài)細(xì)胞的感受率而進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。
7. 平板在 37℃下正向放置 1 小時(shí)后以吸附過多的液體，然后倒置培養(yǎng)過夜。