RT-qPCR實驗教您如何保證RNA的質量

在RT-qPCR實驗中，RNA提取完成后，需要對RNA的質量進行評估，合格后才可進行后續(xù)實驗。評估方法有分光光度計，瓊脂糖凝膠電泳，Agilent 2100分析等，其中常用的有分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳法檢測。我們需要注意的是這兩種方法需要搭配使用，才能完成對RNA濃度、純度和完整度的檢測分析，以保證RNA的質量。

分光光度計：

分光光度計主要用于測定RNA的濃度和純度，但不能對RNA的完整度和基因組殘留進行檢測。其中，A260/280和A260/230是RNA純度檢測的重要參數(shù)，可根據(jù)其數(shù)值的波動，檢測RNA的純度：
1、1.9< A260/280< 2.1，說明RNA純度較好；A260/280<1.9，表示RNA中可能有蛋白殘留；A260/280>2.1，表示RNA可能有部分降解，可經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳進一步確認。
2、2.0< A260/230< 2.2，說明RNA純度較好；A260/230< 2.0，則說明RNA中可能有機試劑殘留，如酚、乙醇或糖類等。

瓊脂糖凝膠電泳：

瓊脂糖凝膠電泳檢測可以分析RNA的完整度，基因組和蛋白殘留，但不能對RNA的濃度準確定量，也不能檢測有機試劑的殘留。以真核生物RNA模板為例：
1、 將RNA進行瓊脂糖凝膠電泳，若膠圖上只有28sRNA、18sRNA和5.8sRNA三條單一的條帶，說明提取的RNA完整度良好。如果出現(xiàn)拖帶的現(xiàn)象，表示RNA部分降解。
2、若膠孔和28sRNA條帶之間出現(xiàn)單一明亮的條帶，表示可能有基因組DNA殘留。
3、若膠孔內(nèi)出現(xiàn)條帶，說明可能有蛋白等大分子物質殘留。


逆轉錄
RNA提取完成后，需要反轉成cDNA才能進行后續(xù)實驗，所以反轉步驟是*的。逆轉錄將從逆轉錄酶的選擇和引物的選擇進行介紹：

逆轉錄酶的選擇：

常見代表性反轉錄酶有AMV RTase和MMLV RTase兩大類：AMV RTase的RNase H活性強，合成長度短，合成量低，熱穩(wěn)定性好（42～55℃）；MMLV RTase的RNase H活性弱，合成長度長，合成量高，熱穩(wěn)定性差（37～42℃）。
由于RNase H酶具有降解RNA模板的功能，所以在逆轉錄時應該優(yōu)先選擇RNase H活性弱的MMLV ，而且后期經(jīng)過基因工程改造，MMLV熱穩(wěn)定性已達到質的飛躍。以Yeasen的Hifair Ⅲ逆轉錄酶（11141）為例，該酶經(jīng)基因工程改造，刪除了RNase H活性，同時反應溫度可達60℃，針對高GC及富含復雜二級結構的模板具有更高的反轉錄效率。

引物的選擇：

通常RT primer可分為三類：oligo dT，隨機引物和基因特異性引物。根據(jù)不同的實驗需求選擇適合的引物進行使用。

1、如果模板為真核生物來源，且后期cDNA用于常規(guī)PCR擴增，建議選擇Oligo（dT）；若后續(xù)實驗僅用于qPCR，建議將Oligo（dT）與隨機引物混合后使用，可提高反轉錄效率。
2、如果模板為原核生物來源，反轉錄請選用Random Primers 或者基因特異性引物。

熒光定量

熒光定量主要從定量方法的選擇、引物設計原則、ROX的選擇、反應體系的配置和反應條件的設置等分別進行闡述： 
 

定量方法的選擇：

定量方法分為相對定量和定量。相對定量可用于檢測某種處理方法對基因表達的影響，檢測基因在不同時間的表達差異和比較基因在不同組織中的表達差異；定量可對病毒中核酸的量進行檢測等。大家在做實驗時，一定要根據(jù)自己的實驗選擇合適的定量方法。