RT-qPCR(實時熒光定量PCR) 實驗手冊

在RT-qPCR實驗中，RNA提取完成后，需要對RNA的質(zhì)量進行評估，合格后才可進行后續(xù)實驗。評估方法有分光光度計，瓊脂糖凝膠電泳，Agilent 2100分析等，其中常用的有分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳法檢測。我們需要注意的是這兩種方法需要搭配使用，才能完成對RNA濃度、純度和完整度的檢測分析，以保證RNA的質(zhì)量。

分光光度計：

分光光度計主要用于測定RNA的濃度和純度，但不能對RNA的完整度和基因組殘留進行檢測。其中，A260/280和A260/230是RNA純度檢測的重要參數(shù)，可根據(jù)其數(shù)值的波動，檢測RNA的純度：
1、1.9< A260/280< 2.1，說明RNA純度較好；A260/280<1.9，表示RNA中可能有蛋白殘留；A260/280>2.1，表示RNA可能有部分降解，可經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳進一步確認。
2、2.0< A260/230< 2.2，說明RNA純度較好；A260/230< 2.0，則說明RNA中可能有機試劑殘留，如酚、乙醇或糖類等。

瓊脂糖凝膠電泳：

瓊脂糖凝膠電泳檢測可以分析RNA的完整度，基因組和蛋白殘留，但不能對RNA的濃度準確定量，也不能檢測有機試劑的殘留。以真核生物RNA模板為例：
1、 將RNA進行瓊脂糖凝膠電泳，若膠圖上只有28sRNA、18sRNA和5.8sRNA三條單一的條帶，說明提取的RNA完整度良好。如果出現(xiàn)拖帶的現(xiàn)象，表示RNA部分降解。
2、若膠孔和28sRNA條帶之間出現(xiàn)單一明亮的條帶，表示可能有基因組DNA殘留。
3、若膠孔內(nèi)出現(xiàn)條帶，說明可能有蛋白等大分子物質(zhì)殘留。


逆轉(zhuǎn)錄
RNA提取完成后，需要反轉(zhuǎn)成cDNA才能進行后續(xù)實驗，所以反轉(zhuǎn)步驟是*的。逆轉(zhuǎn)錄將從逆轉(zhuǎn)錄酶的選擇和引物的選擇進行介紹：

逆轉(zhuǎn)錄酶的選擇：

常見代表性反轉(zhuǎn)錄酶有AMV RTase和MMLV RTase兩大類：AMV RTase的RNase H活性強，合成長度短，合成量低，熱穩(wěn)定性好（42～55℃）；MMLV RTase的RNase H活性弱，合成長度長，合成量高，熱穩(wěn)定性差（37～42℃）。
由于RNase H酶具有降解RNA模板的功能，所以在逆轉(zhuǎn)錄時應(yīng)該優(yōu)先選擇RNase H活性弱的MMLV ，而且后期經(jīng)過基因工程改造，MMLV熱穩(wěn)定性已達到質(zhì)的飛躍。以Yeasen的Hifair Ⅲ逆轉(zhuǎn)錄酶（11141）為例，該酶經(jīng)基因工程改造，刪除了RNase H活性，同時反應(yīng)溫度可達60℃，針對高GC及富含復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)的模板具有更高的反轉(zhuǎn)錄效率。

引物的選擇：

通常RT primer可分為三類：oligo dT，隨機引物和基因特異性引物。根據(jù)不同的實驗需求選擇適合的引物進行使用。

1、如果模板為真核生物來源，且后期cDNA用于常規(guī)PCR擴增，建議選擇Oligo（dT）；若后續(xù)實驗僅用于qPCR，建議將Oligo（dT）與隨機引物混合后使用，可提高反轉(zhuǎn)錄效率。
2、如果模板為原核生物來源，反轉(zhuǎn)錄請選用Random Primers 或者基因特異性引物。

熒光定量

熒光定量主要從定量方法的選擇、引物設(shè)計原則、ROX的選擇、反應(yīng)體系的配置和反應(yīng)條件的設(shè)置等分別進行闡述：

定量方法的選擇：

定量方法分為相對定量和定量。相對定量可用于檢測某種處理方法對基因表達的影響，檢測基因在不同時間的表達差異和比較基因在不同組織中的表達差異；定量可對病毒中核酸的量進行檢測等。大家在做實驗時，一定要根據(jù)自己的實驗選擇合適的定量方法。

引物設(shè)計原則：

qPCR引物設(shè)計的好壞，直接關(guān)乎著擴增效率高低，產(chǎn)物特異性與否。所以正確設(shè)計出好的引物是qPCR成功的第1步。引物設(shè)計在滿足常規(guī)引物設(shè)計的原則上還要注意以下原則：
1、 目的片段長度控制在100 ~ 300 bp；
2、跨外顯子設(shè)計，避免基因組DNA的影響；
3、 設(shè)計的引物需要進行擴增效率的檢測，擴增效率達標（90-110%）才可用于定量實驗；
4、 引物濃度通常在0.1uM-1.0uM之間優(yōu)化選擇。

ROX的選擇：

在定量反應(yīng)過程中，ROX能夠均一化校正儀器的光程差，移液誤差或蒸發(fā)冷凝導(dǎo)致的體積差等，提高結(jié)果的重復(fù)性。但需要注意的是ROX的選擇與儀器相關(guān)，如果qPCR儀有自動校正孔間差的功能，就不需要添加ROX，反之則需要添加ROX校正。小伙伴們在買試劑時一定要根據(jù)所用的儀器型號選擇正確ROX，避免后期出錯。

反應(yīng)體系的配制：

反應(yīng)體積優(yōu)先推薦20ul和50ul。體系配制時要注意以下事項：
1、 反應(yīng)體系需要在超凈工作臺中通風配制；每次實驗都要用新的ddH2O；
2、每次實驗都需要配制NTC來驗證體系中是否存在污染，配制體系時每一對引物都需要做NTC；
3、如果想檢測RNA模板是否有g(shù)DNA殘留，可將每個樣本都配制NRT進行檢測；
4、配制體系時，一個樣本建議至少做3個技術(shù)型重復(fù)；
5、模板為cDNA時，建議稀釋5-10倍，減少反轉(zhuǎn)錄體系對qPCR實驗的抑制作用，模板量需要進行梯度摸索，使CT值落在20-30之間；
6、確定所需的反應(yīng)數(shù)量，在反應(yīng)數(shù)量的基礎(chǔ)上增加5-10%，計算體積配置數(shù)量；
7、體系配制采用能預(yù)混則預(yù)混原則，混勻后離心并保證無氣泡；
8、盡量選擇進口且配套的耗材，如ABI儀器要使用ABI封板膜，伯樂儀器使用配套的白色陶瓷板子