了解PCR儀的技術(shù)種類

1、PCR-SSCP

PCR-SSCP是1989年日本Orita等創(chuàng)建的篩查突變的技術(shù)。它是一種簡單、快速、經(jīng)濟(jì)的點(diǎn)突變篩查手段。PCR-SSCP技術(shù)的基本原理是PCR擴(kuò)增后的DNA-片段經(jīng)變性成單鏈DNA，單鏈DNA在中性聚丙烯酰胺凝膠中電泳時形成不同的立體構(gòu)象，其構(gòu)象直接影響泳動速率，相同長度的 DNA單鏈其核苷酸順序僅有單個堿基的差別，就可以產(chǎn)生立體構(gòu)象的不同，造成泳動速率的不同，產(chǎn)生不同的泳動帶。



PCR擴(kuò)增后的DNA-片段經(jīng)變性成單鏈后在不含有變性劑的中性膠中電泳，與正常比較出現(xiàn)泳動帶的變位即可推測存在堿基置換。其堿基置換的性質(zhì)必須經(jīng)過DNA測序才能確定。因此PCR-SSCP檢測是測序之前突變篩查的常用手段。



為了便于觀察分析結(jié)果，PCR擴(kuò)增體系中常加入a-32P dNTP標(biāo)記PCR產(chǎn)物，電泳后放射自顯影觀察泳動帶的位置。目前也常用銀染法來染色聚丙烯酰胺凝膠上的DNA泳動帶，此方法可避免同位素的污染及對操作者的輻射損傷，但其靈敏度不如用同位素標(biāo)記。單鏈DNA-片段的立體構(gòu)象主要與堿基序列相關(guān)，但也受到其他條件的影響。



因此，PCR-SSCP技術(shù)的關(guān)鍵在于電泳時的諸多條件，如凝膠的組成、電泳的溫度、離子濃度以及影響分子內(nèi)相互作用的其他溶質(zhì)等。PCR-SSCP的缺點(diǎn)是存在假陰性和假陽性，一般對長度不超過300bp的待測片段的檢出率為70~80%。



2、Assembly PCR(也稱作Polymerase Cycling Assembly或PCA)：

組裝PCR通過使用多個具有短重疊區(qū)的長的寡核苷酸來合成長的DNA鏈的方法。通過寡核苷酸產(chǎn)生一條條正向或反向DNA鏈，而寡核苷酸的重疊區(qū)則確定鏈組裝的順序，因此可有選擇性的產(chǎn)生zui終的長鏈DNA分子。



3、Asymmetric PCR：

不對稱PCR，可選擇性的擴(kuò)增出靶DNA的一條鏈，從而用于測序反應(yīng)或制備單鏈雜交探針。反應(yīng)中限制一個引物的加入量，隨著這一引物的用盡，后續(xù)的擴(kuò)增中另一引物延伸的產(chǎn)物量大大過量。這一技術(shù)的關(guān)鍵是使用的限制引物的量要合適，引物量過多，則產(chǎn)物主要是雙鏈DNA；引物量過少，在前幾輪循環(huán)就被耗盡，結(jié)果導(dǎo)致單鏈的產(chǎn)量減少。在不對稱PCR的基礎(chǔ)上發(fā)展出Linear-After-The-Exponential-PCR (LATE-PCR，線性指數(shù)PCR)，使數(shù)量限制的引物比過量的引物的解鏈溫度更高，從而維持較高的反應(yīng)效率。



4、Hot start PCR：

熱啟動PCR，是提高PCR特異性和可信度的zui-好的方法之一。通過阻止溫度升高到變性溫度前的PCR反應(yīng)的發(fā)生而阻止引物與基因組DNA上潛在的高同源性區(qū)域結(jié)合引起的錯誤引發(fā)（mispriming）。同時熱啟動還使引物通過互補(bǔ)區(qū)域堿基配對而擴(kuò)增產(chǎn)生的引物二聚體量大大降低。

熱啟動PCR可通過三種方式實(shí)現(xiàn)：

1)手動熱啟動：配置反應(yīng)液時忽略一種關(guān)鍵成分（聚合酶、Mg離子或dNTP），當(dāng)反應(yīng)液升溫到80℃以上或變性溫度時再加入。手動熱啟動操作繁瑣，而且因?yàn)樵黾恿艘淮伍_蓋操作，增加了污染的機(jī)會，同時由于管與管間的加樣誤差，可能使平行樣品間擴(kuò)增結(jié)果產(chǎn)生差異；更簡單的手動熱啟動是在冰上配置反應(yīng)液，待熱蓋升溫到變性溫度，按下擴(kuò)增儀的暫停鍵，立即將反應(yīng)管放在儀器上開始反應(yīng)，當(dāng)然這種方法的可信度也zui低

2)將聚合酶用石蠟珠包裹（或在反應(yīng)液上部滴一滴融化的石蠟，待其凝固后，將聚合酶加到石蠟層的上部）使其與反應(yīng)液的其它成分分開，直到反應(yīng)液升溫融化石蠟后，酶才進(jìn)入反應(yīng)液中；3)使用熱啟動DNA聚合酶，這種酶通過化學(xué)修飾或與抗體結(jié)合，常溫下沒有活性，而只有當(dāng)反應(yīng)液加熱到變性溫度一段時間后，酶的活性才被釋放。使用熱啟動DNA聚合酶相比手動熱啟動操作簡便，缺點(diǎn)是用熱啟動DNA聚合酶的價格較高。



5、InterSequence-Specific PCR(ISSR-PCR)：

序列間特異性PCR：一種DNA指紋圖譜技術(shù)，所選的引物定位在基因組的片段重復(fù)區(qū)（如Alu族），擴(kuò)增后產(chǎn)生基于不同產(chǎn)物長度的唯-一的指紋圖譜。



6、Ligation-mediated PCR：

連接介導(dǎo)PCR，首先使用小的寡核苷酸接頭連接靶DNA-片段，然后選擇與接頭結(jié)合的PCR引物來擴(kuò)增未知的靶片段。這一技術(shù)主要用在DNA測序、染色體步移技術(shù)（genome walking）和DNA指紋圖譜等。



7、Methylation-specific PCR (MSP)：

甲基化特異性的PCR，用于研究基因組CpG島的甲基化模式。首先是用亞硫酸氫鈉處理靶DNA，使未甲基化的胞嘧啶堿基轉(zhuǎn)化成尿嘧啶，尿嘧啶可被引物識別成胸腺嘧啶，然后分別用能區(qū)分修飾和非修飾模板的不同的引物來擴(kuò)增（一對可識別胞嘧啶引物擴(kuò)增原來甲基化的模板，令一對可識別尿嘧啶或胸腺嘧啶的引物擴(kuò)增非甲基化的模板）。結(jié)合定量PCR，可以對甲基化程度進(jìn)行定量。



8、Multiplex-PCR：

多重PCR，指在一個PCR管中使用多對引物同時擴(kuò)增超過一個的靶基因。同時分析單拷貝基因組的多個基因可避免分別擴(kuò)增這些靶基造成對試劑和模板的浪費(fèi)。使用多重PCR檢測引起遺傳疾病的基因突變時，可以同時擴(kuò)增6個以上的靶點(diǎn)，也可同時檢測食品中多種病原菌的存在。在多重PCR基礎(chǔ)上發(fā)展的Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification(MLPA，多重連接探針擴(kuò)增技術(shù))使用單對引物即可完成對多個靶基因的擴(kuò)增，避免了多重PCR耗時的優(yōu)化步驟。



9、Nested PCR：

巢式PCR，通過使用兩套引物來進(jìn)行兩次連續(xù)的反應(yīng)，用來增加DNA擴(kuò)增的特異性。在第-一次反應(yīng)中產(chǎn)生的產(chǎn)物可能包含非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，然后使用兩個新的、結(jié)合位點(diǎn)位于原引物內(nèi)部的引物進(jìn)行第二次反應(yīng)。第二套引物的使用可提高反應(yīng)的特異性，增大單一產(chǎn)物產(chǎn)生的可能性。巢式PCR在提高特異性的同時，也增加了檢測的靈敏度。



10、Quantitative PCR(Q-PCR)：

定量PCR，用來測定樣本中的靶DNA的量。zui初的定量PCR主要是指Competitive PCR（競爭定量PCR）。競爭定量PCR：在反應(yīng)混合物中加入起始拷貝數(shù)已知的內(nèi)部對照，對照具有同靶序列相同的引物結(jié)合位點(diǎn)，但產(chǎn)生的產(chǎn)物長度與靶序列產(chǎn)生的產(chǎn)物長度不同，在PCR過程中對照與靶基因競爭相同的引物。反應(yīng)后通過比對對照和靶基因產(chǎn)生的產(chǎn)物量推斷初始靶基因的拷貝數(shù)，由于內(nèi)部對照和靶基因在擴(kuò)增中的效率不一定相同，所以定量結(jié)果會產(chǎn)生偏差。



11、Allele-specific PCR：
等位基因特異性PCR，設(shè)計(jì)引物時選擇在基因組的多態(tài)性區(qū)域，使等位基因的突變定位在（或接近）引物的3'端，在嚴(yán)謹(jǐn)?shù)姆磻?yīng)條件下，存在錯配堿基的引物不能起始復(fù)制，而只有*匹配的引物才能起始復(fù)制，產(chǎn)生的產(chǎn)物因此顯示不同的基因型。
12、Touch down PCR

降落PCR，是另一種簡單的降低非特異性擴(kuò)增的方法，可規(guī)避對PCR循環(huán)條件進(jìn)行耗時的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。降落PCR過程中，首輪循環(huán)的退火溫度設(shè)置在比引物的解鏈溫度高出幾度，使每個后續(xù)循環(huán)的退火溫度逐漸降到，直到退火溫度降到等于引物的解鏈溫度或比引物的解鏈溫度低幾度，后續(xù)的循環(huán)在此較低的退火溫度下完成，整個程序的退火溫度可降低10-15℃。在zui初幾個循環(huán)內(nèi)，高溫使引物的非特異性結(jié)合難以發(fā)生，只有同引物互補(bǔ)程度zui大的模板序列（很可能這一序列就是我們感興趣的序列）才能發(fā)生退火事件，因此保證靶序列得到優(yōu)先擴(kuò)增。后續(xù)循環(huán)降低退火溫度可保證擴(kuò)增效率，盡管zui終的退火溫度降低到足以使非特異性產(chǎn)物有效擴(kuò)增的溫度，由于靶分子已經(jīng)開始指數(shù)期擴(kuò)增，因此抑制非特異性產(chǎn)物的進(jìn)一步形成。



13、Long PCR（Long distance PCR，Long range PCR）

長距離PCR，普通的Taq聚合酶一般只能擴(kuò)增不超過3-5kb的片段，通過使用特定的聚合酶和緩沖液成分，來擴(kuò)增較長的DNA鏈（10-40kb以上）。長距離PCR時經(jīng)常會在10-15個循環(huán)后，使每個循環(huán)的延伸時間都比上一循環(huán)的時間增加10秒左右，以補(bǔ)償聚合酶活性的損失。



14、Clony PCR

菌落PCR，通過PCR手段來迅速篩選陽性克隆子。使用滅菌的牙簽將菌落直接挑到反應(yīng)混合液中，通過PCR預(yù)變性步驟的高溫使細(xì)菌的基因組釋放作為PCR反應(yīng)的模板。菌落PCR中使用的引物定位在插入位點(diǎn)外側(cè)的載體區(qū)，因此盡管插入的序列各不相同，也不影響擴(kuò)增反應(yīng)的進(jìn)行。



15、RACE-PCR（rapid amplification of cDNA ends）

一種RT-PCR方法，當(dāng)對DNA序列信息了解較少時，使用單個特異性引物加一個接頭引物來擴(kuò)增cDNA的5'端（對應(yīng)轉(zhuǎn)錄的起始位點(diǎn)）或3'端從而產(chǎn)生新的cDNA，重疊的RACE產(chǎn)物可結(jié)合起來產(chǎn)生全長的cDNA-片段。



16、DD-PCR (differential display)：

差異顯示技術(shù)，用來鑒定不同組織中差異表達(dá)的基因。將不同組織的RT-PCR產(chǎn)物用短的、非特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，然后在凝膠上比對來源于不同組織的條帶，只在某種組織中才出現(xiàn)的條帶被認(rèn)為是差異表達(dá)的。



17、AFLP（Amplified fragment length polymorphism）：

擴(kuò)增片段長度多態(tài)性，通過擴(kuò)增使不同生物基因組呈現(xiàn)不同長度的片段。



18、AP-PCR

(arbitrary primed)/RAPD (random amplified polymorphic DNA)：

隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA，使用隨機(jī)寡核苷酸片段來擴(kuò)增序列未知的靶基因，形成基因組指紋圖譜，用來分析物種的相關(guān)性。



19、Variable Number of Tandem Repeats (VNTR) PCR：

可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列PCR，使引物定位在具有長度多態(tài)性的靶基因區(qū)，通過在凝膠電泳后對產(chǎn)物的大小進(jìn)行分析來研究基因分型。



20、Inverse PCR：

反向PCR，允許擴(kuò)增已知序列側(cè)翼的DNA區(qū)。首先將靶DNA用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行多輪消化，然后連接被消化的片段構(gòu)建環(huán)狀的分子，引物設(shè)計(jì)成可從序列已知的區(qū)域向外側(cè)延伸，結(jié)果擴(kuò)增出環(huán)狀分子上剩余的序列。



21、Real-Time PCR：

實(shí)時PCR，由于通常的PCR在幾十個循環(huán)后都會進(jìn)入平臺期，產(chǎn)物的量與初始模板量不在成正比，因此只能用來定性。而實(shí)時PCR通過使用熒光染料，例如SYBR Green或熒光標(biāo)記探針，例如TaqMan可用來檢測隨著擴(kuò)增的進(jìn)行，產(chǎn)物量的變化而進(jìn)行定量。



22、原位PCR

原位雜交細(xì)胞定位和PCR的高靈敏度相結(jié)合的技術(shù)，使得靶基因檢測有了的改進(jìn)。此技術(shù)是在細(xì)胞（爬片、甩片或涂片）或組織（石蠟、冰凍切片）上直接對靶基因片段進(jìn)行擴(kuò)增，通過摻入標(biāo)記基團(tuán)直接顯色或結(jié)合原位雜交進(jìn)行檢測的方法。



23、RT-PCR（Reverse Transcription PCR）：

逆轉(zhuǎn)錄PCR，是用來擴(kuò)增、分離和鑒定細(xì)胞或組織的信使RNA（mRNA）的技術(shù)。反應(yīng)由兩個階段組成：

1、使用逆轉(zhuǎn)錄酶，通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)“RT”合成與RNA互補(bǔ)的cDNA（complementary DNA）

2、使用PCR擴(kuò)增特異性的cDNA。

由于PCR的預(yù)變性步驟可以用來失活逆轉(zhuǎn)錄酶，所以兩個階段可在同一管內(nèi)完成。一些DNA聚合酶如Tth也有RT活性，因此可以單獨(dú)使用這種酶來完成兩步反應(yīng)。

RT-PCR可廣泛用于表達(dá)圖譜分析（用來確定基因的表達(dá)）；鑒定RNA轉(zhuǎn)錄子的序列，當(dāng)相關(guān)的基因序列已知時，還可進(jìn)一步知道基因組上外顯子和內(nèi)含子的位置；檢測病毒例如HIV、引起麻疹和腮腺炎的病毒。