P產(chǎn)品分類RODUCT CATEGORY
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堿性磷酸酶同工酶檢測(cè)試劑盒(抑制敏感法)的產(chǎn)品組成
產(chǎn)品簡(jiǎn)介:
堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase,簡(jiǎn)稱 ALP 或 AKP)為一類磷酸酯酶,廣泛分布于哺乳動(dòng)物組織內(nèi),其活性所需最適 pH 9.2~9.8,堿性磷酸酶同工酶有肝、骨、小腸、胎盤、
膽汁等同工酶。堿性磷酸酶同工酶檢測(cè)試劑盒(抑制敏感法)采用磷酸苯二鈉比色法,其檢測(cè)原理是磷酸苯二鈉在堿性條件下,可在堿性磷酸酶的作用下生成游離酚和磷酸,在堿性條件下酚與氨基安替比林結(jié)合,并經(jīng)氧化生成紅色醌式結(jié)構(gòu)物,呈深淺不一的紅色,產(chǎn)物紅色越深說(shuō)明堿性磷酸酶活性越高,反之則酶活性越低,通過(guò)比色法(分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀)測(cè)定 510nm 處吸光度,據(jù)此通過(guò)比色分析就可以計(jì)算出總的堿性磷酸酶活性水平;同時(shí)通過(guò)尿
素、苯丙氨酸抑制后測(cè)定殘余 ALP 活性,以確定同工酶的性質(zhì),可用于檢測(cè)細(xì)胞或組織的
裂解液或勻漿液、血漿、血清等樣品中內(nèi)源性的堿性磷酸酶同工酶活性;如果用分光光度計(jì),100T 的檢測(cè)試劑盒可檢測(cè) 33 次左右;如果用酶標(biāo)儀,100T 的檢測(cè)試劑盒可檢測(cè) 330 次左右。該試劑盒僅用于科研領(lǐng)域,不適用于臨床診斷或其他用途。
自備材料:
1、離心管或 96 孔板、水浴鍋或恒溫箱、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀
2、ddH2O 、PBS 或生理鹽水
操作步驟(僅供參考):
1、準(zhǔn)備樣品:
①細(xì)胞或組織樣品:取恰當(dāng)細(xì)胞或組織裂解液,如果有必要可用 PBS 或生理鹽水進(jìn)行適當(dāng)勻漿,一般細(xì)胞數(shù)量在 106 以上,組織應(yīng)在 100mg 以上,3000~4000rpm 離心取上清,-20℃凍存,用于堿性磷酸酶同工酶的檢測(cè)。
②血漿、血清和尿液樣品:血漿、血清按照常規(guī)方法制備后可以直接用于該試劑盒的測(cè)定,尿液通常也可以直接用于測(cè)定,-20℃凍存,但為了消除樣品本身顏色的干擾,需設(shè)置加了血漿或血清但不加底物的對(duì)照。
③高活性樣品:如果樣品中含有較高活性的堿性磷酸酶,可以使用原有的裂解液或 PBS等進(jìn)行稀釋,如雞血清、血漿可稀釋 5~10 倍后檢測(cè)。
2、配制 ALP 顯色試劑:臨用前將 ALP 顯色試劑 A 和 ALP 顯色試劑 B 按 1:2 比例混合即可,不宜長(zhǎng)期保存。
3、配制標(biāo)準(zhǔn)品工作液:取出 Phenol 標(biāo)準(zhǔn)(1mg/ml)恢復(fù)至室溫后,取 0.1ml 溶解于 1.9ml ddH2O,即為 Phenol 標(biāo)準(zhǔn)(0.05mg/ml),按照下表稀釋系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液。
4、分光光度計(jì)測(cè)定(檢測(cè)總 ALP):按照下表設(shè)置對(duì)照管、標(biāo)準(zhǔn)管、尿素測(cè)定管、苯丙測(cè)定
管、總 ALP 測(cè)定管,溶液應(yīng)按照順序依次加入,并注意避免產(chǎn)生氣泡。如果樣品中的堿性磷酸酶同工酶的活性過(guò)高,可以減少樣品用量或適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行測(cè)定,樣品的檢測(cè)最好能設(shè)置平行管以 0 號(hào)管(ddH2O)調(diào)零,比色杯光徑 1cm,以分光光度計(jì)測(cè)定對(duì)照管、標(biāo)準(zhǔn)管、尿素測(cè)定管、苯丙測(cè)定管、總 ALP 測(cè)定管 510nm 處吸光度(即 A 對(duì)照、A 標(biāo)準(zhǔn)、A 測(cè)定)。如無(wú)法檢測(cè) 510nm,亦可檢測(cè) 500~530nm 范圍內(nèi)吸光度,一般應(yīng) 15min 內(nèi)檢測(cè)完畢。
5、酶標(biāo)儀測(cè)定(檢測(cè)總 ALP):按照下表設(shè)置對(duì)照孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、尿素測(cè)定孔、苯丙測(cè)定孔、 總 ALP 測(cè)定孔,溶液應(yīng)按照順序依次加入,并注意避免產(chǎn)生氣泡。如果樣品中的堿性磷酸酯酶活性過(guò)高,可以減少樣品用量或適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行測(cè)定,樣品的檢測(cè)最好能設(shè)置平行孔。
計(jì)算:堿性磷酸酶金氏活性單位的定義:在 37℃條件下,100ml 待測(cè)樣品與顯色底物(即
磷酸苯二鈉)作用 15min,產(chǎn)生 1mg 酚為一個(gè)金氏單位(U/L)。
以系列 Phenol 標(biāo)準(zhǔn)(1~6 號(hào)管)對(duì)應(yīng)的金氏單位為橫坐標(biāo),以相應(yīng)的 A 標(biāo)準(zhǔn)(1~6 號(hào)管)
為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(亦可分別制作標(biāo)準(zhǔn)曲線)。以(A 測(cè)定-A 對(duì)照)之差值為實(shí)際的吸光度,
用該差值與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行對(duì)比,求出總 ALP、 尿素抑制 ALP、苯丙抑制 ALP 活性單位。
尿素抑制 ALP 殘余活性百分率=尿素抑制 ALP 殘余活性/總 ALP 活性×100%
苯丙抑制 ALP 殘余活性百分率=苯丙抑制 ALP 殘余活性/總 ALP 活性×100%
注意事項(xiàng):
1、 待測(cè)樣品中不能含有磷酸酶抑制劑,同時(shí)需避免反復(fù)凍融。
2、 如果沒(méi)有分光光度計(jì),也可以使用酶標(biāo)儀測(cè)定,但應(yīng)注意 96 孔板最大檢測(cè)體積,推薦采用分光光度計(jì)檢測(cè)。
3、 所測(cè)樣品的值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線的上限,應(yīng)稀釋樣品后重新測(cè)定。
4、 如果空白管/孔顯紅色,說(shuō)明 ALP 顯色液不可用,應(yīng)丟棄。
5、 加入顯色基液時(shí)應(yīng)迅速,并且及時(shí)混勻,否則顯色不充分。
6、 為了您的安全和健康,請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
有效期:6 個(gè)月有效。常溫運(yùn)輸,4℃保存。
堿性磷酸酶同工酶檢測(cè)試劑盒(抑制敏感法)的產(chǎn)品組成
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